Electroforesis bidimensional de campos pulsados en minicámaras para caracterizar los cromosomas de Cryptococcus neoformans: procedimiento bioinformático.
Cryptococcus neoformans is a pathogenic yeast that causes meningoencephalitis, specially in AIDS patients. Epidemiological studies of clinical isolates have been encouraged due to the increase in its incidence for infection monitoring and control. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) is the most...
| Publicado en: | Revista CENIC Ciencias Biológicas Vol. 46; no. 2; pp. 119 - 131 |
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| Autor principal: | |
| Formato: | Artículo |
| Publicado: |
Centro Nacional de Investigaciones Cientificas
may-ago2015
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| Acceso en línea: | Ver este registro en EBSCOhost |
| Sumario: | Cryptococcus neoformans is a pathogenic yeast that causes meningoencephalitis, specially in AIDS patients. Epidemiological studies of clinical isolates have been encouraged due to the increase in its incidence for infection monitoring and control. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) is the most popular technique for microbial molecular subtyping with epidemiological purpose, because of its versatility and reproducibility, but the analysis of eukaryotic genomes, like C. neoformans, in a single PFGE experiment, does not reveal mutations that do not alter the chromosomes size. That is why the author proposes a two-dimensional PFGE methodology for the C. neoformans genome characterization. The present describes the bioinformatic procedure used to design and verify in silico the efficacy of such methodology. The resolution of the intact chromosomes was achieved in the first dimension (1D) after 9.3 h of electrophoresis in the CHEF minichamber, applying pulses between 30 and 90s. The chromosomal fingerprint was obtained in the second dimension (2D) after restrict the individual bands with Not I or Sfi I and then separate the fragments in the CHEF minichamber applying pulses between 1 and 15 s for 5 h. The proposed methodology reveals the genetic differences in the genome of C. neoformans strains that were invisible in 1D, in 14.3 h of electrophoresis (1D + 2D), in contrast with the 30-40 h that takes a PFGE in regular electrophoretic chambers. Such methodology could be applied for studying the genome of other unicellular eukaryotic species. Cryptococcus neoformans es una levadura que provoca meningoencefalitis comúnmente en pacientes inmunodeprimidos. El incremento en su incidencia ha motivado estudios epidemiológicos de aislados clínicos para establecer redes de vigilancia. La electroforesis de campos pulsados (ECP) es una de las técnicas más utilizadas en la subtipación molecular de microorganismos con fines epidemiológicos, por su versatilidad y reproducibilidad; sin embargo, el análisis del genoma de eucariotas mediante un único experimento de ECP solo revela aquellas mutaciones que modifican el tamaño de sus cromosomas. El presente trabajo propone una metodología para caracterizar el genoma de C. neoformans mediante ECP bidimensional y describe el procedimiento bioinformático que permitió el diseño y la comprobación in silico de la utilidad de dicha metodología. La separación de los cromosomas intactos de las cepas estudiadas en la primera dimensión (1D) se logra en 9.3 h de ECP en una cámara miniCHEF, aplicando tiempos de pulso (tp) entre 30 y 90 s. La huella digital cromosomal se obtuvo en la segunda dimensión (2D) después de la restricción de las bandas obtenidas en 1D con Not I o Sfi I y la separación de los fragmentos en la cámara miniCHEF, aplicando tp entre 1 y 15 s durante 5 h. Esta metodología evidencia las diferencias genéticas entre cepas de C. neoformans invisibles en la 1D, luego de 14,3 h de electroforesis (1D + 2D), en contraste con las 30 a 40 h que tomaría una ECP en cámaras CHEF convencionales. Esta metodología pudiera implementarse para el estudio del genoma de otras especies de eucariotas unicelulares. |
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